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May 16, 2024

Modellierung der Inaktivierungskinetik von Escherichia coli, Salmonella Enteritidis und Bacillus subtilis, behandelt mit einem Multi

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12058 (2023) Diesen Artikel zitieren 174 Zugriffe auf Metrikdetails Die Wirksamkeit der dielektrischen Barrierenentladungsbehandlung mit mehreren Hohlräumen gegen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12058 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Wirksamkeit der dielektrischen Barrierenentladungsbehandlung mit mehreren hohlen Oberflächen gegen Escherichia coli, Salmonella Enteritidis und Bacillus subtilis wurde untersucht. Als Arbeitsgas wurden Umgebungsluft, O2 und N2 mit einem Durchfluss von 6 l/m verwendet. Die ins Plasma abgegebene Leistung betrug 30 W über eine Fläche von 2 × 2 cm2. Die aktiven Spezies im Plasma, die in verschiedenen Gasen erzeugt werden, die an der Inaktivierung von Mikroorganismen beteiligt sind, wurden durch optische Emissionsspektroskopie und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie bewertet. Inaktivierungskurven wurden an die logarithmisch-linearen, biphasischen und Geeraerd-Modelle von Bigelow angepasst. Den Ergebnissen zufolge inaktivierten alle Plasmabehandlungen die getesteten Mikroorganismen, abhängig von einem Arbeitsgas. Die größte Empfindlichkeit der Bakterien wurde gegenüber dem Umgebungsluftplasma beobachtet. Eine Inaktivierung von bis zu 5 log für E. coli und S. Enteritidis konnte innerhalb von 15 s nach der Plasmabehandlung erreicht werden. Eine 25-sekündige Luftplasma-Exposition führte auch zu einem log10-KBE/ml-Wert von B. subtilis von 7,98 auf 4,39. S. Enteritidis zeigte eine leichte Resistenz gegenüber der Plasmabehandlung mit N2. Innerhalb einer 180-sekündigen Stickstoffplasmabehandlung wurde eine Reduzierung um 2,04 log10 KBE/ml festgestellt.

Das durch verschiedene dielektrische Barriereentladungen (DBDs) erzeugte Niedertemperaturplasma (LTP) hat in vielen Lebensmittelmatrizen, einschließlich Frischprodukten wie Kirschtomaten und Erdbeeren1, Gewürzen2,3,4 oder Nüssen5,6, eine potenzielle antimikrobielle Wirkung gezeigt. Die antimikrobielle Wirkung von LTP resultiert aus verschiedenen möglichen Reaktionen zwischen verschiedenen Spezies, die während der Plasmabehandlung auftreten7. Art und Konzentration dieser reaktiven Spezies hängen vom Plasmasystem und den angewandten Betriebsparametern ab, einschließlich Arbeitsgas, Feuchtigkeit und Energiezufuhr5,6,7. Beispielsweise sind reaktiver Sauerstoff (Wasserstoffperoxid, Hydroxylradikal, Superoxid, Singulett-Sauerstoff, atomarer Sauerstoff und Ozon) und Stickstoffspezies (Peroxynitrit, Stickoxid und Nitrit), UV-Photonen und geladene Teilchen die wesentlichen bakteriziden Wirkstoffe in LTP, die in der Umgebung erzeugt werden Luft7,8.

Das OH-Radikal, ein im Plasma gebildetes ROS, spielt aufgrund seines hohen Oxidationspotentials eine wichtige Rolle bei der Inaktivierung verschiedener Krankheitserreger9. Laut Procházka et al.10 verstärkt ein koplanares DBD, das in Wasserdampf gezündet wird, die Erzeugung von OH-Radikalen. Allerdings führt die Zugabe von Wasserdampf zur Luft zu einem Anstieg der für die LTP-Erzeugung erforderlichen Spannung oder verhindert sogar die Plasmaerzeugung. Die genannten Einschränkungen führten zur Entwicklung eines effektiven Entladungsdesigns für die Zuverlässigkeit der Plasmaquelle in einer potenziellen Anwendung9.

Eine neue Geometrie der dielektrischen Barrierenentladung mit mehreren Hohlräumen (MSDBD) kombiniert die Oberflächen- und Volumengeometrie von DBD-Plasmasystemen11,12. Der MSDBD besteht aus zwei parallelen Elektroden, die vollständig in Keramik eingebettet sind, um eine Erosion der Elektroden zu verhindern. Das MSDBD-System enthält 105 Löcher, in denen das Plasma in einem geeigneten Arbeitsgas erzeugt wird und der Fluss (5–20 l/min) die Übertragung aktiver Partikel auf die behandelte Probe gewährleistet. Darüber hinaus führen die einzigartige Geometrie und der Kühleffekt zu einer hohen Ausbeute an aktiven Partikeln, einschließlich Ozon, und ermöglichen die Plasmabehandlung von Proben in größeren Entfernungen oder Modellen mit strukturierter Oberfläche11. Die detaillierte Beschreibung der MSDBD-Geometrie und der Eigenschaften des erzeugten Plasmas finden Sie im Artikel von Homola et al.13.

Mikrobielle Lebensmittelsicherheit und Konservierungstechniken sind eines der kritischsten Themen in der Lebensmittelindustrie. Lebensmittelbedingte Infektionen, die durch pathogene Mikroorganismen verursacht werden, können sich negativ auf die öffentliche Gesundheit und die sozioökonomische Entwicklung auswirken14. Die Kontamination von Lebensmitteln mit verderblichen Bakterien kann zum Vorhandensein mikrobieller Toxine führen und stellt somit eine Gesundheitsgefährdung für die Verbraucher dar1. Beispielsweise wurde im Jahr 2011 in Deutschland ein Ausbruch des Shigatoxin-produzierenden Escherichia coli O104:H4 mit dem Verzehr von Bockshornkleesprossen in Verbindung gebracht15. Darüber hinaus wurden Krankheitserreger wie E. coli O157:H7 und Salmonella spp. möglicherweise über längere Zeiträume überleben1. Andererseits ist Bacillus subtilis, einer der am häufigsten vorkommenden sporenbildenden Bakterien in Gewürzen, ein lebensmittelvergiftendes Bakterium. Dieses Bakterium gilt als nicht krankheitserregend für den Menschen, verursacht jedoch gelegentlich charakteristische toxische Infektionen, die zu schwerem Erbrechen, Bauchkrämpfen und Durchfall führen. Darüber hinaus ist B. subtilis in der Lage, den Sterilisationsprozess zu überleben16.

Wie oben erwähnt, haben sich viele Studien auf die Inaktivierung pathogener Mikroorganismen durch LTP konzentriert. Die Nutzung von Umgebungsluft stellt jedoch zahlreiche Herausforderungen im Prozess der Plasmaerzeugung dar (übermäßig hohe Leistungsanforderungen, erhöhte Gastemperaturen und störende Instabilitäten)13, was zur Entwicklung alternativer Designs der Entladungskonfigurationen führt. Verschiedene Studien zeigten das Potenzial von MSDBD für die Plasmabehandlung in der Lebensmittelverarbeitung17,18. Die Studie von Kelar Tučeková et al.9 zeigte das Potenzial der MSDBD-Behandlung zur Dekontamination von bakteriellem Biofilm.

Allerdings gibt es unseres Wissens keine Studien, die die antimikrobielle Wirkung der MSDBD-Behandlung zur Dekontamination von mit pathogenen Bakterien kontaminierten Lebensmitteln beschreiben. Darüber hinaus könnte die Modellierung der Inaktivierungskinetik wichtige Informationen über den Mechanismus der Plasmabehandlung liefern. Die Inaktivierungskinetik kann ein nützliches Instrument sein, um das Verhalten der Inaktivierung von Mikroorganismen unter bestimmten Verarbeitungsbedingungen vorherzusagen und zu vergleichen19. Darüber hinaus kann es die besten Behandlungsbedingungen für die wirksamste Inaktivierung vorhersagen. Bei minimaler Verarbeitung werden bei der Inaktivierung normalerweise nichtlineare Eigenschaften wie Tailing-, Schulter- und Sigmoideffekte beobachtet. Diese Nichtlinearitäten könnten durch verschiedene weit verbreitete nichtlineare kinetische Modelle19,20 gut beschrieben werden, darunter Weibull21, das Biphasic-Modell22 und viele mehr.

Ziel der Studie war es daher, das kinetische Verhalten von E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis zu bestimmen und zu vergleichen, die mit MSDBD-Plasma behandelt wurden, das in verschiedenen Arbeitsgasen erzeugt wurde. Die kinetischen Parameter für die Inaktivierung von Bakterienzellen wurden ebenfalls geschätzt. Darüber hinaus wurden optische Emissionsspektroskopie und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie zur Charakterisierung der verschiedenen erzeugten Plasmen eingesetzt.

Die getesteten Bakterienstämme E. coli CCM 3988, S. enterica subsp. enterica Serovar Enteritidis CCM 4420, B. subtilis CCM 1999 (vegetative Form), wurden aus der Sammlung von Mikroorganismen, Masaryk-Universität, Brünn, Tschechische Republik, erhalten.

Der Bakterienstamm wurde 24 Stunden lang bei 37 °C in Nähragar gezüchtet und dann bei 4 °C gehalten. Vor jedem Test wurden 7 ml sterile Nährbrühe aseptisch mit einer Kolonie der getesteten Bakterien beimpft. Die Zellsuspension wurde 16 Stunden lang bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln (320 U/min) inkubiert. Die ungefähre Dichte lebensfähiger Zellen betrug 2–5 × 108 Zellen/ml.

Geschmolzener steriler Nähragar Nr. 2 wurde in einen Thermostat überführt und 30 Minuten lang bei 60 °C gehalten. Anschließend wurden 2,5 ml des vorbereiteten Nähragars in eine sterile Glasplatte pipettiert. Nach dem Erstarren des Agars (bei 25 °C) wurde die Scheibe mit einem sterilen Schneidgerät (Ø 22 mm) geschnitten und vorsichtig in einen sterilen Objektträger in einer Petrischale überführt. Der Inhalt der Petrischale wurde über Nacht bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Anschließend wurden 15 µl der erhaltenen Bakterienzellsuspension (zehnfach verdünnt) auf einer Scheibe ausgebreitet und etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur einweichen gelassen.

Das für die Probenbehandlung verwendete Plasma (Abb. 1) wurde mit dem RPS30-Gerät (Roplass Ltd, CZ) mit einer Multi-Hollow Surface Dielectric Barrier Discharge (MSDBD)-Plasmaeinheit12 erzeugt. Die Bedingungen wurden auf Basis der bisherigen Untersuchungen13 optimiert. Das Arbeitsgas (Umgebungsluft, Sauerstoff und Stickstoff) strömt mit einer Durchflussrate von 6 l/m durch eine Anordnung von 105 Hohlräumen im MSDBD-System. Die Plasmafläche beträgt 2 × 2 cm2 und die in das Plasma abgegebene Leistung betrug 30 W. Die Proben wurden in einem Abstand von 1 mm von der Oberfläche der MSDBD-Keramik behandelt. Die Plasmabehandlung erfolgte im Abstand von 45 s. Danach wurde der RPS30 200 s lang abgekühlt. Bei einer Expositionszeit von weniger als 45 s war die Abkühlzeit proportional zur Expositionszeit, um die stabile Temperatur während der Plasmabehandlung aufrechtzuerhalten.

Der MSDBD-Apparat.

Die Proben wurden bis zu 180 s behandelt. Die Gesamtbehandlungszeit variierte je nach Arbeitsgas und verwendeten Bakterienstämmen. Nach der Behandlung wurde der Reaktor sofort mit Isopropylalkohol gereinigt und mit dem Arbeitsgas getrocknet. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die Zusammensetzung des durch MSDBD erzeugten Plasmas wurde durch optische Emissionsspektroskopie (OES) und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) analysiert.

Die Emissionsspektren von in Umgebungsluft, Sauerstoff und Stickstoff erzeugtem Plasma wurden in einem dynamischen Bereich mit dem Spektrometer StellarNet EP-2000 im Bereich von 200–1100 nm (StellarNet, USA) erfasst. Die Detektorintegrationszeit betrug 100 ms und die Spektren wurden während 100 Scans integriert. Die optische Faser wurde auf einer Achse senkrecht zur Keramikebene in einem Abstand von 5 cm platziert. Das FTIR in Umgebungsluft, O2 und N2 wurde mit dem Spektrometer Bruker Vector 22 (Bruker Optics, USA) in einem Spektralbereich von 4000–500 cm−1 mit einer Auflösung von 4 cm−1 mit 8/8 Scans für den Hintergrund gemessen ( Arbeitsgas) und Plasma eingeschaltet. Die Spektren wurden im Durchflussregime aufgenommen und die im Plasma erzeugten Produkte wurden mit einer Weglänge von 10 cm in die Küvette geleitet.

Die Anzahl der überlebenden Bakterien nach der MSDBD-Behandlung wurde mit der Standardmethode zur Plattenzählung ermittelt. Die Plasmabehandlungsscheibe wurde in 3 ml 0,85 %ige sterile Kochsalzlösung eingetaucht; Die Mischung wurde 60 s lang bei Raumtemperatur gevortext. Die erhaltene Suspension wurde seriell verdünnt und jede Lösung wurde auf Mueller-Hinton-Agarplatten gegeben. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und die koloniebildenden Einheiten (KBE) wurden gezählt. Als Kontrollprobe wurde ein unbehandelter Agarring verwendet.

Inaktivierungskurven wurden erstellt, indem die logarithmische Überlebensfraktion gegen die Plasmabehandlungszeit aufgetragen wurde. Die kinetischen Parameter für die Inaktivierung von Bakterienzellen wurden mithilfe von logarithmisch linearen, biphasischen und Geeraerd-Modellen geschätzt.

Das logarithmisch-lineare Modell23 wurde mit der GInaFit-Software (Version 1.7 für Microsoft Excel24) an die Inaktivierungsdaten angepasst, wie in den Gleichungen gezeigt. (1 und 2):

wobei Nt die Anzahl der überlebenden lebensfähigen Zellen (KBE/ml) nach der Plasmabehandlung zum Zeitpunkt t darstellt; N0 stellt die anfänglichen Zellpopulationen (KBE/ml) zum Zeitpunkt 0 dar; D ist die dezimale Reduktionszeit (D-Wert); kmax stellt die spezifische Inaktivierungsrate (s−1) dar; t stellt die Einwirkzeit jeder Behandlung(en) dar.

Das zweiphasige Modell22 wurde mit der GInaFit-Software (Version 1.7 für Microsoft Excel24) modelliert, wie in den Gleichungen gezeigt. (3–5):

wobei Nt die Anzahl der überlebenden lebensfähigen Zellen (KBE/ml) nach der Plasmabehandlung zum Zeitpunkt t darstellt; N0 stellt die berechneten anfänglichen Zellpopulationen (KBE/ml) dar; kmax1 (s−1) und kmax2 (s−1) stellen die Inaktivierungsraten für die Population dar, die der Subpopulation entspricht, die empfindlicher auf die Behandlung reagiert (f) und für die Population, die der Subpopulation entspricht, die resistenter gegen die Behandlung ist (1 − f) , jeweils; D1- und D2- sind D-Werte für beide Regionen.

Das Geeraerd-Modell25 wurde mit der GInaFit-Software (Version 1.7 für Microsoft Excel24) modelliert, wie in Gl. (6):

wobei Nt die überlebende Keimzahl (KBE/ml) nach der Plasmabehandlung zum Zeitpunkt t ist; N0 ist die berechnete anfängliche Zellpopulation (KBE/ml); Nres ist die verbleibende Subpopulation (KBE/ml); kmax (s−1) ist die maximale spezifische Inaktivierungsrate; D ist die dezimale Reduktionszeit (s)

Es wurden wiederholte Datensätze aufgezeichnet, um mittlere Überlebenskurven zusammen mit Standardabweichungen zu erhalten. Signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mithilfe der Einweg-ANOVA-Analyse und anschließendem Bonferroni-Korrektur-Post-Hoc-Test auf dem Niveau p ˂ 0,05 ermittelt.

Die Werte stellen die Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) aus vier Experimenten dar.

Optische Emissionsspektren von durch MSDBD in verschiedenen Arbeitsgasen erzeugtem Plasma sind in Abb. 2 A dargestellt. Der dominante Strahlungsübergang, der in den in Umgebungsluft und Stickstoffplasma aufgenommenen Spektren sichtbar ist, ist das zweite positive System des Stickstoffmoleküls N2 (C3 Πu → B3 Πg). Dieses System ist die primäre Strahlungsquelle im UV-Bereich und erfolgt bei der Dekontaminationswirkung von Plasma in einer stickstoffhaltigen Atmosphäre26. Bei geringer Intensität können das erste negative System von N+2 (B2 Σ+u → X2 Σ+g) und das erste positive System N2 (B3 Πg → A3 Σ+u) erkannt werden.

Die optischen Emissionsspektren von Plasma (A) und FTIR-Analyse gasförmiger Produkte (B), die durch MSDBD in verschiedenen Arbeitsgasen (Umgebungsluft, Sauerstoff, Stickstoff) erzeugt werden.

In Sauerstoff zeigten die Emissionsspektren im Messbereich keine Strahlungsübergänge. Andererseits weisen in Stickstoff aufgenommene Spektren starke Peaks auf, die dem zweiten positiven System und auch der Strahlung von NO-Molekülen (A2 Σ+ → X2 Π) durch die Wechselwirkung von Umgebungsluft mit im Arbeitsgas erzeugten Stickstoffspezies zugeschrieben werden.

Die FTIR-Analyse (Abb. 2B) von in der Umgebungsluft gemessenen gasförmigen Produkten zeigte eine Vielzahl aktiver Partikel; Die dominierenden Spitzenwerte werden Ozon, Stickoxiden (N2O, NO2) und HNO2 zugeschrieben. Darüber hinaus wurde HNO3 aufgrund der vorhandenen Luftfeuchtigkeit in der Umgebungsluft nachgewiesen. Diese Arten sind stark bioaktiv und spielen eine wesentliche Rolle bei der Dekontaminationswirkung von Plasma. Im Sauerstoff wurde die intensive Produktion von Ozon beobachtet. Der MSDBD ist aufgrund der Konfiguration und des Betriebs im Arbeitsgasstrom eine Plasmaquelle mit hoher Ozonausbeute. In Homola et al.11 wurde festgestellt, dass die Effizienz der Ozonproduktion höher ist als bei anderen Standard-DBD-Geometrien – koplanare DBDs, Oberflächen- und Volumen-DBDs.

Die Temperatur der umgebenden Objekte, die mit dem Plasma in Kontakt kommen (insbesondere der zur Probenaufnahme verwendete Tisch und die Keramikoberfläche), wurde mit der Wärmebildkamera Flir C5TM Compact Thermal Camera (Teledyne Flir, Estland) überwacht. Die maximale Temperatur im Behandlungsbereich betrug bis zu 40 °C (Abb. 3). Darüber hinaus hat das strömende Arbeitsgas eine erhebliche Kühlwirkung13.

Das Bild von MSDBD mit einer Wärmebildkamera bei 0 s und 45 s; Temperatur gemessen im Behandlungsbereich zwischen Keramik und Tisch zur Probenaufbewahrung.

Eine zeitliche Verlaufsstudie zur Inaktivierung von E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis durch verschiedene Plasmen zeigte deutliche Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber dieser Behandlung für die drei Stämme. Die kinetischen Profile der Überlebenskurven getesteter Mikroorganismen, die aus verschiedenen Arbeitsgasen gewonnen wurden, schienen im halblogarithmischen Maßstab nichtlinear zu sein (Abb. 4 und 5), mit Ausnahme von Stickstoffplasma für E. coli und S. Enteritidis ( Abb. 6). Die angepassten Parameter der Inaktivierungskinetik für alle Modelle für getestete Mikroorganismen, die mit MSDBD-Plasma behandelt wurden, das in verschiedenen Prozessgasen erzeugt wurde, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Ergebnisse der statistischen Analyse der kinetischen Änderungen für alle getesteten Mikroorganismen bei der Plasmabehandlung unter Verwendung von Vorhersagemodellen sind in zusammengefasst Tabelle 2.

Auswirkungen der MSDBD-Plasmabehandlung auf die Inaktivierung von E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis für Umgebungsluft als Arbeitsgas.

Auswirkungen der MSDBD-Plasmabehandlung auf die Inaktivierung von E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis für Sauerstoff als Arbeitsgas.

Auswirkungen der MSDBD-Plasmabehandlung auf die Inaktivierung von E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis für Stickstoff als Arbeitsgas.

Die überlebende Population von E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis nach der Behandlung mit luftbasiertem Plasma ist in Abb. 4 dargestellt. Der Inaktivierungseffekt nahm mit der Expositionszeit zu; Alle getesteten Bakterien zeigten ein nichtlineares Inaktivierungsverhalten (Tabelle 1).

Aufgrund seiner Flexibilität wurde zunächst das Weibull-Modell verwendet. Basierend auf der grafischen Verarbeitung der Inaktivierungsdaten mithilfe des Weibull-Modells wurde jedoch mit hoher Wahrscheinlichkeit das Vorhandensein von Subpopulationen mit unterschiedlichen Resistenzen identifiziert. Daher wurde ein zweiphasiges Cerf-Modell22 angewendet. In unserem Fall bestand der Vorteil dieses Modells in seiner Fähigkeit, geeignete Parameter kmax1 und kmax2 sowie D1- und D2-Werte bereitzustellen, die praktische Bedeutung haben und letztendlich das Vorhandensein von zwei Subpopulationen getesteter Mikroorganismen mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber Plasmabehandlung bestätigten. Allerdings wies das Cerf-Modell für E. coli und S. Enteritidis höhere Fehler bei den Modellparametern auf (Daten nicht gezeigt). Dieses Problem wurde gelöst, indem die experimentellen Ergebnisse mit dem Geeraerd-Modell25 angepasst wurden.

Die Daten legen nahe, dass die Modelle die Inaktivierungsmuster getesteter Mikroorganismen, die aus verschiedenen Plasmen gewonnen wurden, zufriedenstellend erklären; ein R2-Wert ˃ 0,9 (Tabelle 2). E. coli und S. Enteritidis schienen empfindlicher auf die auf Umgebungsluft basierende Plasmabehandlung zu reagieren (Abb. 4). Die 15-sekündige Behandlung reduzierte die Population von E. coli und S. Enteritidis um 4,70 log10 bzw. 4,81 log10. Im Vergleich zur anfänglichen Population von B. subtilis (7,98 ± 0,087 log10 KBE/ml) wurde der mikrobielle Reduktionsgrad von 3,59 log10 nach 25 s Probenexposition im Plasma erreicht.

Für die kinetische Analyse wurde der größte Teil der ursprünglichen Population während des ersten Teils der Behandlung inaktiviert. Aus den zweiphasigen Cerf- und Geeraerd-Modellen waren die Inaktivierungsraten (kmax1) und die dezimale Reduktionszeit (D1) für empfindliche Subpopulationen bei den getesteten Bakterien ähnlich (Tabelle 1). Aus diesem Grund war die antibakterielle Wirkung von Umgebungsluftplasma in der ersten Phase der Inaktivierungskurve bei dem getesteten Bakterienstamm vergleichbar. Darüber hinaus zeigten die höchsten Inaktivierungsraten für empfindliche Subpopulationen die schnellste Inaktivierung von S. Enteritidis und B. subtilis im Luftplasma im Vergleich zur O2- und N2-basierten Plasmabehandlung.

Die O2-basierte Plasmabehandlung führte auch zu einem nichtlinearen Inaktivierungsverhalten bei allen getesteten Bakterien (Abb. 5), was auf das Vorhandensein empfindlicher und resistenterer Fraktionen innerhalb der Ausgangspopulation hinweist. Allerdings waren die untersuchten Bakterien gemäß den aus dem Cerf-Modell ermittelten D-Werten gegenüber O2-basiertem Plasma etwas resistenter als bei der Luftplasmabehandlung (Tabelle 1). E. coli zeigte einen niedrigeren D1-Wert der empfindlichen Zellen und höhere Inaktivierungsraten für die empfindliche Fraktion (kmax1), was auf die höchste Empfindlichkeit gegenüber der O2-basierten Plasmabehandlung unter den getesteten Bakterien hinweist. Nach 120 s Behandlung war die anfängliche Population von E. coli (8,67 ± 0,128) um ​​4,43 log10 verringert. Im Vergleich zur ursprünglichen Population von S. Enteritidis (8,67 ± 0,020) wurde nach 120 s Probenexposition im Plasma ein mikrobieller Reduktionsgrad von 3,92 log10 erreicht. Die Daten zeigten, dass B. subtilis mit niedrigen Inaktivierungsraten und den höchsten D-Werten für die empfindliche und resistente Fraktion resistenter war (Tabelle 1). Trotz einer langsameren Inaktivierungskinetik reduzierte die O2-basierte Plasmabehandlung die anfängliche Anzahl von B. subtilis (7,79 ± 0,116) um 4,43 log10.

Die MSDBD-Plasmabehandlung mit N2 als Arbeitsgas führte zu einem unterschiedlichen Inaktivierungsverhalten der behandelten Bakterien (Abb. 6). Unsere Ergebnisse deuten auf eine Ähnlichkeit des Verhaltens und der Überlebensfähigkeit von mit Stickstoffplasma behandeltem B. subtilis mit der Sauerstoffplasmabehandlung hin (Tabelle 1). Für die kinetische Analyse enthielt die Inaktivierungskurve von B. subtilis eine nach oben gerichtete Konkavität. Das Abklingen der Inaktivierungskurve zeigt das Vorhandensein einer empfindlicheren und einer resistenteren Fraktion innerhalb der Anfangspopulation an. B. subtilis zeigte den höchsten Wert für kmax1 und den niedrigsten Wert für D1- für die empfindliche Fraktion, was auf die schnellste Devitalisierungskinetik unter den getesteten Mikroorganismen hinweist. Anschließend wurde eine KBE-Reduktion der resistenten Fraktion abgemildert. Die durch N2-basiertes Plasma erhaltenen Inaktivierungskurven von E. coli und S. Enteritidis verliefen nach einem linearen Muster (Abb. 6), und die experimentellen Daten wurden mithilfe eines logarithmisch linearen Modells angepasst23. Hohe R2- und niedrige RMSSE-Werte zeigten die entsprechende Anpassungsfähigkeit eines bestimmten Modells zur Beschreibung der Inaktivierungsdaten für beide Krankheitserreger (Tabelle 2). Trotz der langsameren Inaktivierungskinetik für E. coli war die Wirkung von Stickstoffplasma auf die genannten Bakterien mit der von B. subtilis vergleichbar. Im Vergleich zur Anfangspopulation von B. subtilis (7,91 ± 0,16 log10 KBE/g Probe) und E. coli (8,39 ± 0,03 log10 KBE/g Probe) wurde in 180 s ein mikrobieller Reduktionsgrad von 4,27 log10 und 4,40 log10 erreicht Probenexposition im Plasma. Andererseits zeigte S. Enteritidis im Vergleich zu E. coli und B. subtilis die höchste Zellüberlebensrate. Innerhalb von 180 s der N2-basierten Plasmabehandlung wurde eine Reduzierung der KBE um 2,04 log10 beobachtet. Den Daten zufolge war S. Enteritidis resistenter und hatte eine niedrige Inaktivierungsrate.

Die mathematische Modellierung des mikrobiellen Wachstums oder der Inaktivierungskinetik ist eines der wesentlichen Elemente der quantitativen Expositions- und Risikobewertung. Darüber hinaus kann prädiktive Modellierung verwendet werden, um die Wirksamkeit verschiedener Verarbeitungstechnologien bei der Reduzierung mikrobieller Populationen zu vergleichen27.

Um geeignete Plasmabehandlungsbedingungen festzulegen, ist die Anwendung eines zuverlässigen kinetischen Modells für die mikrobielle Inaktivierung unerlässlich19.

In der vorliegenden Studie wurde die dielektrische Barrierenentladung mit mehreren Hohlräumen (MSDBD) erfolgreich auf die Inaktivierung von E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis, abhängig vom Arbeitsgas, getestet.

Reaktive Spezies (ROS, RNS, Ozon usw.) gelten als entscheidender Faktor, der für die Wirkung von Niedertemperaturplasma auf lebende Zellen verantwortlich ist28. Abhängig vom Plasmasystem und den angewandten Betriebsparametern entstehen komplexe Gemische unterschiedlicher Komponenten, die zur Inaktivierung von Mikroorganismen beitragen können7,28. Wie in Abb. 2 A und B zu sehen ist, liefert in der Umgebungsluft erzeugtes MSDBD eine große Vielfalt an bioaktiven Stickstoff- und Sauerstoffspezies. Im Vergleich zu Standard-DBD-Geometrien (koplanar, Oberfläche oder Volumen)3 weist in Umgebungsluft erzeugtes MSDBD-Plasma aufgrund des Kühleffekts der erzeugten aktiven Spezies durch einen Arbeitsgasstrom, der Eigenschaften von Keramik und der Geometrie auch eine deutlich höhere Effizienz der Ozonproduktion auf des Elektrodensystems. Darüber hinaus führt die Anwesenheit von Wasser als Luftfeuchtigkeit zur Bildung von HNO2 und HNO3 aus Stickoxiden und Hydroxylradikalen, einer der aktivsten ROS. Das in Wasserdampf gezündete koplanare DBD erzeugt Plasma mit einer zehnmal höheren Konzentration an OH-Radikalen als die Entladung in feuchter Luft10. Laut Eto et al.29 könnten OH-Radikale durch die chemische Reaktion zwischen Ozon und Wasserdampf entstehen und eine Rolle bei der Inaktivierung von Geobacillus stearothermophilus-Sporen spielen. Darüber hinaus war das erzeugte Luftplasma eine Quelle für Stickstoffspezies und UV-Photonen (Abb. 2A).

Inaktivierungskurven von E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis unter verschiedenen Plasmen zeigten ein signifikantes Tailing (Abb. 4 und 5), mit Ausnahme von Stickstoffplasma für E. coli und S. Enteritidis (Abb. 6). Die gemessenen Inaktivierungsdaten wurden mit drei kinetischen Modellen erster Ordnung angepasst, darunter dem Bigelow-Log-Linear23, dem biphasischen Cerf22 und dem Geeraerd25-Modell. Das zweiphasige Modell wird normalerweise für Inaktivierungskurven infolge einer Aktivität ungleich Null während längerer Behandlungen verwendet19,27. Andererseits beschreibt das Geeraerd-Modell die empfindliche und die resistente Population, die nicht inaktiviert ist25. R2 (˃ 0,9) zeigte die Eignung der verwendeten Modelle zur Beschreibung der Inaktivierungskinetik an (Tabelle 2). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Krankheitserreger anfälliger für die Exposition gegenüber Plasma in der Umgebungsluft sind, da ihre anfängliche Anzahl nach kürzeren Behandlungszeiten im Vergleich zu Plasmen auf O2- und N2-Basis erheblich reduziert wurde. Bei luft- und O2-basierten Plasmen war das Inaktivierungsverhalten der getesteten Bakterien in der Form der Kurven ähnlich; Auf eine schnellere Inaktivierungsrate zu Beginn der Plasmabehandlung folgte ein Tailing (Abb. 4 und 5). Die Form der Inaktivierungsdaten deutete auf das Vorhandensein einer plasmaempfindlichen und einer plasmaresistenten Population hin (Tabelle 1). Abgesehen von den verschiedenen Inaktivierungsmechanismen, die während der Behandlung involviert sind4, könnte das Auftreten von Tailing auch durch die physikalisch-chemischen Prozesse erklärt werden, die während der Inaktivierung ablaufen. Inaktive Zellen könnten eine mechanische Barriere bilden und ein bevorzugtes Ziel für aktive Partikel sein. Der Sättigungsgrad aktiver Partikel sollte ebenfalls berücksichtigt werden, ebenso wie Reparaturmechanismen, die aufgrund des oxidativen Stresses durch RONS übernommen werden. Wie in den Abb. gezeigt. 4 und 5: E. coli und S. Enteritidis waren im Vergleich zu B. subtilis anfälliger für die luft- und O2-basierten Plasmabehandlungen. Dieses Phänomen könnte mit den Unterschieden in der Struktur, der chemischen Zusammensetzung und der molekularen Organisation der Zellwände zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien zusammenhängen27. Grampositive Bakterien könnten aufgrund einer dickeren Außenmembran resistent gegen die Behandlung mit atmosphärischem Kaltplasma sein, was die Diffusion reaktiver Plasmaspezies durch die Bakterienzellwand verringern kann1. Bei den gewählten Modellen waren die Inaktivierungsraten für die getesteten Bakterien während der ersten Inaktivierungsphase vergleichbar, was aus den kmax1- und D1-Werten hervorgeht (Tabelle 1).

Andererseits führte die Verwendung von N2-basiertem Plasma zu einem anderen Inaktivierungsverhalten von E. coli und S. Enteritidis; Die Inaktivierungskurven zeigten Linearität (Abb. 6). Trotz des Fehlens einer resistenten Fraktion war S. Enteritidis im Vergleich zu E. coli und B. subtilis resistenter und hatte niedrige Inaktivierungsraten. Hertwig et al.5 berichteten auch über eine geringere Inaktivierungswirkung der Stickstoffplasmabehandlung auf Salmonella Enteritidis PT 30. Dies könnte mit der Resistenz von Salmonella spp. zusammenhängen. zur UV-Behandlung30. Die erhaltenen OES- und FTIR-Spektren (Abb. 2A und B) zeigten, dass N2-basiertes Plasma UV-Strahlung emittiert, was eine Rolle spielen könnte.

Die vorgestellte Studie zeigte, dass die MSDBD-Plasmabehandlung Lebensmittelverderbniserreger, darunter E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis, wirksam inaktivierte. Durch den Wechsel der Arbeitsgase konnten Plasmen unterschiedlicher Zusammensetzung mit unterschiedlichem Inaktivierungsgrad erzeugt werden. Unter den verwendeten Arbeitsgasen war Umgebungsluftplasma bei der Inaktivierung der genannten Krankheitserreger am wirksamsten. Die im Plasma erzeugten reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS) sind die Hauptverursacher der Dekontaminationswirkung bei der raumluftbasierten Plasmabehandlung. Darüber hinaus könnte die Inaktivierung mit Ozon zusammenhängen, dessen Produktionseffizienz mit MSDBD-Plasma wesentlich höher ist als mit gewöhnlichen DBD-Geometrien (Volumen, Oberfläche oder koplanar). Darüber hinaus verursachte Wasser in Form von Luftfeuchtigkeit die Bildung von Hydroxylradikalen, einem der wirksamsten ROS, und HNO2 und HNO3 aus Stickoxiden.

Den Ergebnissen dieser Studie zufolge ist MSDBD-Plasma, das in verschiedenen Arbeitsgasen erzeugt wird, eine potenzielle Technologie zur Inaktivierung von Krankheitserregern wie E. coli, S. Enteritidis und B. subtilis. Um die geeigneten Behandlungsbedingungen für die wirksamste Inaktivierung zu bestimmen, ist die Modellierung der Inaktivierungskinetik hilfreich, um das Verhalten der getesteten Mikroorganismen unter verschiedenen Plasmabehandlungen zu verstehen. Das biphasische Modell lieferte geeignete Parameter kmax1 und kmax2 sowie f, die praktische Bedeutung haben und letztendlich das Vorhandensein von zwei Subpopulationen getesteter Mikroorganismen mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber Plasmabehandlung bestätigten. Da es sich hierbei jedoch um vorläufige Ergebnisse handelt, sind weitere Untersuchungen erforderlich, insbesondere im Hinblick auf die Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen, Lebensmittelprodukten und Plasma.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor, [SM], erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von der slowakischen Förderagentur Nr. 1/0515/21, 1/0688/22 und der slowakischen Forschungs- und Entwicklungsagentur im Rahmen des Vertrags Nr. APVV-21-0147 unterstützt.

Abteilung für Ernährung und Lebensmittelqualitätsbewertung, Fakultät für Chemie- und Lebensmitteltechnologie, Slowakische Technische Universität, Radlinského 9, Bratislava, 811 07, Slowakische Republik

Silvia Mošovská, Ľubomír Valík und Anna Mikulajová

Abteilung für Experimentalphysik, Fakultät für Mathematik, Physik und Informatik, Mlynská Dolina F1, Bratislava, 842 48, Slowakische Republik

Veronika Medvecká & Anna Zahoranová

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Konzeptualisierung, Schreiben – Vorbereitung und Überprüfung des Originalentwurfs: SM, VM, Ľ.V., AM und AZ; Datenanalyse: SM, VM und Ľ.V.; Finanzierungseinwerbung: SM, VM und AZ

Korrespondenz mit Silvia Mošovská.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mošovská, S., Medvecká, V., Valík, Ľ. et al. Modellierung der Inaktivierungskinetik von Escherichia coli, Salmonella Enteritidis und Bacillus subtilis, behandelt mit einem dielektrischen Barriere-Entladungsplasma mit mehreren Hohlräumen. Sci Rep 13, 12058 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38892-2

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Eingegangen: 16. Februar 2023

Angenommen: 17. Juli 2023

Veröffentlicht: 25. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38892-2

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